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DESARROLLO DE DOS ENFOQUES DIRIGIDOS POR ARN PARA TRATAR LAS VARIANTES RECURRENTES DE GLICINA p.G284R y p.G293R en COL6A1

Descripción del proyecto:

Las distrofias musculares por déficit de colágeno VI (DM-COL6) son un grupo de trastornos neuromusculares congénitos caracterizados por debilidad muscular generalizada, contracturas progresivas y disfunción respiratoria, para los que no existe un tratamiento eficaz. Esta patología suele estar causada por variantes patogénicas de carácter dominante negativo en alguno de los genes del colágeno VI (COL6A1, COL6A2 o COL6A3), como, por ejemplo, las sustituciones de una glicina en ciertas regiones altamente conservadas del gen (secuencias Gly-X-Y). Dos de las sustituciones de glicina más comunes, localizadas en las posiciones p.G284R y p.G293R se encuentran en la cadena alfa1(VI) de la proteína del colágeno, específicamente en una región en la que es muy frecuente observar este tipo de mutaciones dominantes negativas.

Las terapias dirigidas por ARN ofrecen grandes oportunidades para silenciar o editar estas mutaciones dominantes negativas si se diseñan para que se unan de forma selectiva al alelo mutante, sin afectar al alelo sano. Si se consigue anular la expresión del alelo mutante, la copia sana que permanece inalterada es capaz de producir suficiente colágeno sano como para que no se manifieste la patología.

 

Proyecto 1: Diseño de una terapia basada en RNAs de interferencia (siRNAs) para silenciar de forma específica el alelo mutado, en casos de sustitución de la glicina dominantes negativas causantes de distrofia muscular por déficit de colágeno VI

Para que las terapias genéticas basadas en ARN puedan alcanzar su máximo potencial en el tratamiento de enfermedades genéticas dominantes es necesario diseñar oligonucleótidos antisentido (siRNA) que sean muy activos, pero a la vez muy específicos para el alelo mutante, dejando la expresión del alelo sano inalterada. Abordar el tratamiento de mutaciones de un único par de bases resulta muy complicado ya que el alelo mutante difiere de la copia normal en un solo nucleótido. Buscando aumentar la selectividad del siRNA llevamos a cabo una serie de experimentos en células que presentan una mutación relativamente frecuente en esta patología y que consiste en una sustitución de la glicina (G293R) en el gen de COL6A1. Para ello, introdujimos deliberadamente un segundo error en la secuencia del siRNA (además de la mutación patológica), para debilitar la unión del éste al alelo sano, pero manteniendo su capacidad de unión al alelo mutante. Mediante sondas fluorescentes y utilizando fibroblastos de la cepa HEK293, analizamos varios siRNAs, cada uno de los cuales tenía el segundo error localizado en una posición diferente. Gracias a ello, identificamos al menos dos siRNAs que conservan una elevada capacidad de silenciar el alelo mutante, al tiempo que mantienen intacta la expresión del alelo normal. El tratamiento de fibroblastos obtenidos de pacientes con estos siRNAs permitió recuperar la estructura de la matriz de colágeno VI.

Sin embargo, para poder utilizar estos siRNAs como un tratamiento es necesario poderlos administrar de forma eficaz a los pacientes. Ello requiere, por un lado, que estos RNA sean estables y, por otro, que lleguen de forma efectiva a los fibroblastos intersticiales del músculo, que son las células encargadas de producir el colágeno 6. Esto puede lograrse mediante modificaciones químicas, estabilizando el siARN para lograr que su eficacia y su distribución se mantengan también in vivo. Una completa estabilización química es esencial para lograr una eficacia adecuada in vivo, pero ello puede afectar significativamente a su capacidad de reconocimiento de la diana y, por ende, a su especificidad contra el alelo mutante.

En colaboración con la Dra. Anastasia Khvorova del RNA Therapeutics Institute, proponemos realizar una serie de cribados sistemáticos de diversos siRNAs modificados químicamente contra dos mutaciones por sustitución de glicina en COL6A1 (la mencionada G293R y la más común G284R). Las pruebas se realizarán in vitro en fibroblastos obtenidos de pacientes e in vivo en los modelos de ratón humanizados con dichas mutaciones.

Presupuesto: US$ 50.000/año

 

Proyecto 2: Uso de guías de ARN circular para corregir una región habitual de aparición de mutaciones de sustitución de glicina en DM-COL6

La mayoría de las mutaciones que causan un error de lectura de la glicina están producidas por el cambio de un único nucleótido: una guanosina (G) que cambia a adenosina (A). Esto las hace susceptibles al uso de una estrategia de corrección del ARN basada en el uso de las deaminasas de adenosina o ADARs, unas enzimas producidas de forma natural por la propia célula. Las ADARs actúan sobre los ARN de doble cadena y catalizar el cambio de una adenosina (A) a inosina (I), la cual imita a la guanosina durante el proceso de la traducción del mensaje en proteína, revirtiendo el error de forma efectiva.

En un primer intento, quisimos corregir la copia mutante utilizando oligonucleótidos largos de ARN capaces de reclutar ADARs endógenos hasta el punto de la mutación, con el objetivo de corregir la secuencia mutante. El resultado no fue detectable debido a que los ARN largo utilizados eran muy inestables y fueros degradados rápidamente en el interior de la célula.

En este proyecto proponemos utilizar un nuevo enfoque utilizando ARN circulares reclutadores de ADAR, los cuales dirigirán las enzimas ADAR endógenas al punto de la mutación para que transformen de forma específica la adenosina en inosina. Esto constituiría una estrategia terapéutica válida para las distrofias por déficit de colágeno VI causadas por cambios G>A. La circularización del ARN mejora su estabilidad y aumenta su resistencia a las exonucleasas celulares, mejorando la eficacia y durabilidad del efecto de la edición programada del ARN. De Sorprendentemente, los resultados preliminares en células HEK293T utilizando una sonda fluorescente que detecta los alelos mutados G284R y G293R, mostraron porcentajes de edición de ARN de hasta el 22% y el 25%, respectivamente, utilizando un único ARN circular reclutador de ADAR. Este enfoque se probará de nuevo in vivo en modelos de ratón humanizados, utilizando un vector para su administración.

Presupuesto: US$ 75.000/año

 

Lugar de desarrollo:
NINDS National Institute of Neurological Disease and Stroke, Bethesda, Maryland EEUU y otros lugares si así se considerase oportuno.

Investigadores implicados:
Dr. Bönnemann, Carsten G., MD.
Dra. Veronique Bolduc, PhD
Dra. Astrid Brull, PhD

Duración del proyecto y periodo de apoyo por Fundación Noelia:
2 años (Abril 2023 – Abril 2025)

Inversión total:
250.000 DOLARES

Aportaciones realizadas por Fundación Noelia:
Abril 2023: 125.000 $ (Justificante de transferencia)

Aportaciones pendientes de realizar por Fundación Noelia:
Abril 2024: 125.000 $

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